ہیموگلوبن الیکٹروفورسس کا تجربہ

تجرباتی اصول

ہیموگلوبن الیکٹروفورسس کا مقصد مختلف عام اور غیر معمولی ہیموگلوبنز کا پتہ لگانا اور تصدیق کرنا ہے۔

ہیموگلوبن کی مختلف اقسام کے مختلف چارجز اور آئیسو الیکٹرک پوائنٹس کی وجہ سے، ایک مخصوص پی ایچ بفر محلول میں، جب ہیموگلوبن کا آئیسو الیکٹرک پوائنٹ بفر محلول کے پی ایچ سے کم ہوتا ہے، تو ہیموگلوبن منفی چارج رکھتا ہے اور الیکٹروفورسس کے دوران انوڈ کی طرف ہجرت کرتا ہے۔ اس کے برعکس، مثبت چارج کے ساتھ ہیموگلوبن کیتھوڈ کی طرف بڑھتا ہے۔

ایک مخصوص وولٹیج کے تحت اور ایک مخصوص الیکٹروفورسس وقت کے بعد، مختلف چارجز اور مالیکیولر وزن کے ساتھ ہیموگلوبنز مختلف نقل مکانی کی سمتوں اور رفتار کو ظاہر کرتے ہیں۔ یہ الگ الگ زونوں کو الگ کرنے کی اجازت دیتا ہے، اور مختلف ہیموگلوبنز کی مقدار معلوم کرنے کے لیے ان زونز پر بعد میں کلوریمیٹرک یا الیکٹروفوریٹک اسکیننگ کا تجزیہ کیا جا سکتا ہے۔ سب سے زیادہ استعمال شدہ طریقہ پی ایچ 8.6 سیلولوز ایسٹیٹ میمبرین الیکٹروفورسس ہے۔

سائٹوپلازم کے اندر، ایتھیلین گلائکول گروپس (CHOH-CHOH) جو گلائکوجن یا پولی سیکرائیڈ مادوں میں موجود ہیں (جیسے میوکوپولیساکرائیڈز، میوکوپروٹینز، گلائکوپروٹینز، گلائکولپڈز، وغیرہ) کو متواتر تیزاب کے ذریعے آکسائڈائز کیا جاتا ہے اور الڈیہائیڈ گروپس (CHOHCHOH) میں تبدیل کیا جاتا ہے۔ یہ ایلڈیہائیڈ گروپس بے رنگ جامنی سرخ شِف ری ایجنٹ کے ساتھ مل کر ایک جامنی سرخ رنگ بناتا ہے جو سیل میں پولی سیکرائڈز موجود ہوتے ہیں۔ اس ردعمل کو پیریڈک ایسڈ-شِف (PAS) سٹیننگ کے نام سے جانا جاتا ہے، جسے پہلے گلائکوجن سٹیننگ کہا جاتا تھا۔

تجربہ کا طریقہ

مواد:سیلولوز ایسیٹیٹمیمبرین، الیکٹروفورسس اپریٹس(DYCP-38C اور بجلی کی فراہمی DYY-6C), اعلی نمونہ لوڈ کرنے کا آلہ (پائپیٹ), سپیکٹرو فوٹومیٹر، رنگین میٹرک کیویٹ, بفرز

بفر:

(1) پی ایچ 8.6 ٹی ای بی بفر: وزن 10.29 جی ٹریس، 0.6 جی ای ڈی ٹی اے، 3.2 جی بورک ایسڈ، اور ڈسٹل واٹر کو 1000 ملی لیٹر میں شامل کریں۔

(2) بوریٹ بفر: وزن 6.87 گرام بوریکس اور 5.56 جی بورک ایسڈ، اور کشید پانی کو 1000 ملی لیٹر میں شامل کریں۔

طریقہ کار:

Pہیموگلوبن حل کی مرمت

3 ملی لیٹر خون لیں جس میں ہیپرین یا سوڈیم سائٹریٹ بطور اینٹی کوگولنٹ ہو۔ 2000 rpm پر 10 منٹ کے لیے سینٹری فیوج کریں اور پلازما کو ضائع کر دیں۔ خون کے سرخ خلیوں کو تین بار جسمانی نمکین (750 rpm، 5 منٹ سینٹرفیوگریشن ہر بار) سے دھوئے۔ 10 منٹ کے لیے 2200 rpm پر سینٹری فیوج کریں اور سپرنٹنٹ کو ضائع کر دیں۔ مساوی مقدار میں آست پانی شامل کریں، پھر کاربن ٹیٹرا کلورائیڈ کے حجم سے 0.5 گنا زیادہ شامل کریں۔ 5 منٹ کے لیے زور سے ہلائیں، اور پھر 2200 rpm پر 10 منٹ کے لیے سنٹری فیوج کریں تاکہ بعد میں استعمال کے لیے اوپری Hb محلول جمع کیا جا سکے۔

جھلی کو بھگونا

سیلولوز ایسیٹیٹ جھلی کو 3 سینٹی میٹر × 8 سینٹی میٹر کی پٹیوں میں کاٹ دیں۔ انہیں pH 8.6 TEB بفر میں مکمل طور پر سیر ہونے تک بھگو دیں، پھر فلٹر پیپر سے ہٹا کر خشک کریں۔

اسپاٹنگ

10 μl ہیموگلوبن محلول کو عمودی طور پر سیلولوز ایسٹیٹ جھلی (کھردرا سائیڈ) پر، کنارے سے تقریباً 1.5 سینٹی میٹر کے فاصلے پر دیکھنے کے لیے ایک پپیٹ استعمال کریں۔

الیکٹروفورسس

بوریٹ بفر محلول کو الیکٹروفورسس چیمبر میں ڈالیں۔ سیلولوز ایسیٹیٹ جھلی کو چیمبر کے کیتھوڈ سرے پر دھبے والے سائیڈ کے ساتھ رکھیں۔ 200 V پر 30 منٹ تک چلائیں۔

Elution

HbA اور HbA2 زون کو کاٹ دیں، انہیں الگ الگ ٹیسٹ ٹیوب میں رکھیں، اور بالترتیب 15 ملی لیٹر اور 3 ملی لیٹر ڈسٹل واٹر شامل کریں۔ ہیموگلوبن کو مکمل طور پر ختم کرنے کے لیے آہستہ سے ہلائیں، پھر مکس کریں۔.

رنگ کی پیمائش

اخراج کے محلول کے لیے کشید پانی کا استعمال کرتے ہوئے جاذب کو صفر کریں اور 415 nm پر جاذب کی پیمائش کریں۔

حساب کتاب

HbA2(%) = HbA2 ٹیوب کا جذب / (HbA ٹیوب کا جذب × 5 + HbA2 ٹیوب کا جذب) × 100%

تجرباتی نتائج کا حساب کتاب

پی ایچ 8.6 TEB بفر سیلولوز ایسیٹیٹ الیکٹروفورسس کے لیے حوالہ کی حد: HbA > 95%، HbA2 1%-3.1%

نوٹس

الیکٹروفورسس کا وقت زیادہ طویل نہیں ہونا چاہئے۔ الیکٹروفورسس کے دوران سیلولوز ایسیٹیٹ جھلی کو خشک نہیں ہونا چاہئے۔ جب HbA اور HbA2 واضح طور پر الگ ہوجائیں تو الیکٹروفورسس کو روکیں۔ طویل الیکٹروفورسس بینڈ کے پھیلاؤ اور دھندلا پن کا سبب بن سکتا ہے۔

بہت زیادہ نمونہ استعمال کرنے سے گریز کریں۔ ضرورت سے زیادہ ہیموگلوبن مائع بینڈ سے لاتعلقی یا ناکافی داغ کا باعث بن سکتا ہے، جس کے نتیجے میں HbA کی سطح غلط طور پر بڑھ جاتی ہے۔

پروٹین کے ساتھ سیلولوز ایسیٹیٹ جھلی کی آلودگی کو روکیں۔

کرنٹ بہت زیادہ نہیں ہونا چاہیے؛ دوسری صورت میں، ہیموگلوبن بینڈ الگ نہیں ہوسکتے ہیں۔

ہمیشہ عام افراد کے نمونے اور ضروری معلوم غیر معمولی ہیموگلوبنز کو بطور کنٹرول شامل کریں۔

بیجنگ لیوئی بائیوٹیکنالوجی ہیموگلوبن الیکٹروفورسس کے لیے پیشہ ورانہ الیکٹروفورسس ٹینک تیار کرتی ہے جو کہ ماڈل ہے۔DYCP-38Cسیلولوز ایسٹیٹ میمبرین الیکٹروفورسس ٹینک، اور سیلولوز ایسٹیٹ میمبرین الیکٹروفورسس ٹینک کے لیے الیکٹروفورسس پاور سپلائی کے دو ماڈل دستیاب ہیں۔DYY-2CاورDYY-6Cبجلی کی فراہمی

دریں اثنا، بیجنگ لیوئی بائیو ٹیکنالوجی گاہکوں کے لیے سیلولوز ایسیٹیٹ جھلی فراہم کرتی ہے، اور سیلولوز ایسیٹیٹ جھلی کا سائز اپنی مرضی کے مطابق کیا جا سکتا ہے۔ نمونے اور مزید معلومات کے لیے ہم سے پوچھنے میں خوش آمدید۔

بیجنگ لیوئی برانڈ کی چین میں 50 سال سے زیادہ کی تاریخ ہے اور کمپنی پوری دنیا میں مستحکم اور اعلیٰ معیار کی مصنوعات فراہم کر سکتی ہے۔ ترقی کے سالوں کے ذریعے، یہ آپ کی پسند کے قابل ہے!

اب ہم شراکت داروں کی تلاش میں ہیں، OEM الیکٹروفورسس ٹینک اور تقسیم کار دونوں کا خیرمقدم کیا جاتا ہے۔

اگر آپ کے پاس ہماری مصنوعات کی خریداری کا کوئی منصوبہ ہے، تو براہ کرم ہم سے رابطہ کرنے میں سنکوچ نہ کریں۔ آپ ہمیں ای میل پر پیغام بھیج سکتے ہیں۔[ای میل محفوظ]یا[ای میل محفوظ]، یا براہ کرم ہمیں +86 15810650221 پر کال کریں یا Whatsapp +86 15810650221، یا Wechat: 15810650221 شامل کریں۔